8歳の時に両親が謎の失踪をとげたピーター・パーカー(アンドルー・ガーフィールド)は、伯父夫婦のベン(マーティン・シーン)とメイ(サリー・フィールド)に育てられた。
正義感が強い青年だったが、両親に捨てられた心の傷は深く、自分の殻にこもりがちな性格で、密かに想いを寄せる同級生のグウェン・ステイシー(エマ・ストーン)にも気持ちを告げられずにいた。
ある日自宅で、ピーターは父親の残していった鞄を見つける。そこには、父の親友だった著名な生物学者コナーズ博士(リス・エヴァンズ)と父の関わりを記したメモが。
父のことを知りたいピーターは、オズコープ社で遺伝子を研究するコナーズ博士を訪ねるが、そこで遺伝子操作の実験中の蜘蛛にかまれてしまう。一方、コナー ズ博士は、ピーターの父親譲りの才能に感銘を受ける。
翌日、ピーターの体内では大きな異変がおこっていた。
超人的な運動能力と瞬発力を身につけ、蜘蛛のように壁面に張り付くことができるようになったのだった。
ピーターは突然のことに戸惑うが、ある事をきっかけに"スパイダーマン"となってニューヨークの悪者退治を始める。
お互いに化学の才能に秀でたピーターとグウェンの仲も進展していく。ピーターの秘密を知りながら彼を受け入れるグウェン。しかし、グウェンの父親はスパイダーマンを敵とみなし逮捕状を出す。
その頃、ニューヨークの町では夜になると巨大な爬虫型生物が出没していた。その生物はピーターがコナーズ博士の研究を手伝ったが故に生み出してしまった怪 物であった。自責の念に駆られるピーター。自ら始めたことに決着をつける日がきた。ピーターは自らの過去と向き合い運命を選択することとなる。